UKK - Usein kysyttyjä kysymyksiä, vastauksineen
Mikä on oligonukleotidi?
-Oligonukleotidi on lyhyt, synteettinen DNA-molekyyli, joka koostuu maksimissaan noin 150 nukleotidista. Nukleotidissa voi olla yksi neljästä luonnollisesta emäksestä: adeniini, tymiini, guaniini tai sytosiini. On olemassa myös synteettisiä analogeja kuten inosiini. Oligonukleotideja kutsutaan myös oligoiksi, alukkeiksi, koettimiksi, primereiksi tai probeiksi. Näillä sivuilla oligonukleotidejä kutsutaan yksinkertaisesti oligoiksi.
Ovatko oligot yksi- vai kaksijuosteista DNA:ta?
-Oligot ovat yleensä yksijuosteisia. Oligot syntetisoidaan yksijuosteisena 3'-päästä 5'-päähän. Siis päinvastoin kuin DNA-polymeraasit toimivat. Joissain sovelluksissa, kuten käytettäessä adaptereja, tarvitaan kaksijuosteisia oligoja.
Mitä kemiaa oligoiden syntetisoinnissa käytetään?
-Oligot syntetisoidaan kiinteässä faasissa fosforamidiitti (PA) -kemiaa käyttäen.
Miten oligot syntetisoidaan?
-Oligot syntetisoidaan automatisoidussa 96-kanavaisessa nukleiinihapposyntetisaattorissa. Oligot syntetisoidaan 3'-päästä 5'päähän, päinvastoin kuin DNA-polymeraasit toimivat. Synteesi koostuu seuraavista vaiheista:
CPG-alustan lataaminen. Yleensä 3'-pään terminaalinen fosforamidiitti (FA) on kiinni CPG-kantajassa. Fosforamidiitin 5'-OH -ryhmä on suojattu dimetyylitrityyli-ryhmällä ei-toivottujen reaktioiden ehkäisemiseksi.
CPG:hen sidotun fosforamidiitin 5'-OH -ryhmän suojauksen poistaminen (deprotektio).
Seuraavan FA:n liittäminen molekyyliketjun 5'-OH -ryhmään fosfiittimuodossa.
Reagoimattomien FA-molekyylien inaktivointi.
Liitetyn FA:n hapettaminen fosfiitista fosfaatiksi, jolloin rakenne stabiloituu.
Paluu synteesisilmukan kohtaan kaksi, tai oligon irroittaminen CPG-kantajasta, mikäli halutun mittainen oligo on syntetisoitu.
Miten oligot puhdistetaan ja minkä puhdistustavan valitsen?
-Oligoita voidaan puhdistaa monilla eri tavoilla. Oligomer tarjoaa neljä erilaista puhdistusmenetelmävaihtoehtoa:
Standardideprotektoidut oligot. Oligot deprotektoidaan (ks. kysymys % ) ammoniumhydroksidi-liuoksessa, niiden konsentraatio mitataan ja ne kuivataan. Deprotektoidut oligot toimivat PCR-reaktioissa ja sekvensoinnissa.
Presipitaatiopuhditus. Oligot puhdistetaan saostamalla etanolissa natriumasetaatilla. Presipitaatiopuhdistus sopii lyhyille (<50 emästä) ja modifioimattomille oligoille, kuten esimerkiksi PCR-alukkeille. Pidemmät ja modifioidut oligot vaativat tehokkaampaa vajaamittaisten synteesituotteiden poistoa.
Kasetti-käänteisfaasipylväspuhdistus (RPC). RPC-puhdistus on kromatografinen käänteisfaasimenetelmä, jossa suojattu oligo sidotaan pylvään absorptiomateriaaliin. Vajaamittaiset oligot ja suolat huuhdellaan pylväästä pois ennen oligojen deprotektiota ja eluointia. Tämä on suositeltava peruspuhditusmenetelmä, jos ei tarvita erityisen puhdasta tuotetta.
Käänteisfaasi-HPLC -puhdistus (RP-HPLC). Käänteisfaasi-korkean suorituskyvyn nestekromatografiapuhdistus poistaa tuotteesta vajaamittaiset sekvenssit, suolat, kiinnittymättömän leiman sekä modifioitumattomat sekvenssit. RP-HPLC-puhdistuksen periaate on sama kuin RPC-puhdistuksessa. Suojattu oligo kiinnitetään pylvään seinämään ja epäpuhtaudet huuhdellaan pois. Lopuksi puhdistettu tuote deprotektoidaan ja eluoidaan loivalla liuotingradientilla. Tämä menetelmä sopii erityisesti modifioiduille ja pitkille oligoille.
Applikaatio
Suositeltava puhditustapa
PCR
Presipitaatio/RPC
Cycle Sequencing
Presipitaatio/RPC
Sequencing with fluorescent primers
RP-HPLC
Cloning
RPC/RP-HPLC
Mutagenesis
RPC/RP-HPLC
Antisense
RP-HPLC
Mikä synteesiskaala sopii minulle parhaiten?
Oligomer tarjoaa viisi erilaista synteesiskaalaa. Synteesiskaala ilmoittaa ensimmäisen emäksen määrän mooleissa. Se on synteesin stoikiometrinen maksimisaanto. Riippuen tarpeistasi ja applikaatioistasi voit tilata oligosi 10 nmol:n, 40 nmol:n, 200 nmol:n, 1 µmol:n tai 2+ µmol:n skaaloissa. Muutamaan PCR-reaktioon riittää 10nmol miniprimer-skaala. Nyrkkisääntönä voidaan pitää sitä, että yksittäinen PCR-reaktio vaatii vähintään 10 pmol kumpaakin aluketta.